CRISPR/sgRNA-SAM-терапия: потенциальный прорыв в лечении болезни Паркинсона?

В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Gene Therapy, ученые использовали систему CRISPR-Cas9, чтобы вызвать синтез дофамина (DA) в мозге крыс на модели болезни Паркинсона (БП).

Справочная информация

Заболеваемость БП увеличивается с возрастом и является вторым по распространенности неврологическим заболеванием. БП обусловлено дегенерацией дофаминергических нейронов в substantia nigra pars compacta, которые вырабатывают ДА для регуляции двигательного контроля.

Оптимальным подходом к лечению БП является применение леводопы (L-DOPA) - предшественника, способствующего образованию и замещению ДА. Важно отметить, что эффективность такого лечения имеет ограниченный срок действия, который обычно составляет около пяти лет.

Астроциты имеют решающее значение для иммунологического ответа мозга при БП, что подтверждается на животных моделях и посмертными исследованиями. Тирозингидроксилаза (Th) - фермент, обнаруженный в астроцитах, который имеет решающее значение для выработки ПДР. Ранее авторы настоящего исследования сообщали, что имплантация астроцитов, экспрессирующих Th, успешно увеличивает выработку ДА в страте как в крысиной, так и в нечеловеческой модели БП.

Кластеризованные регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы, ассоциированные с Cas (CRISPR-Cas), - это новая технология, которая произвела революцию в генной терапии. Synergistic activation mediator (SAM) - это система CRISPR второго поколения, которая активирует экспрессию генов с помощью ферментативно неактивного Cas9 (dCas9) и ко-транскрипционных активаторов.

В настоящем исследовании изучено влияние активации эндогенных генов на стимуляцию выработки ДА в астроцитах с последующей имплантацией этих клеток в крысиную модель БП. Полученные результаты позволяют предложить целевой терапевтический подход, который может увеличить безлекарственный период лечения и сочетаться с другими методами терапии в запущенных случаях БП.

Об исследовании

Исследователи проанализировали геном крысы с целью выявления потенциальных последовательностей малых направляющих рибонуклеиновых кислот (sgRNA), которые обладали высокой специфичностью и не совпадали с другими участками генома крысы. В результате было идентифицировано 13 sgRNA для активации гена th.

Уровень мессенджерной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) Th в клетках С 6, трансфицированных выбранными sgRNA, оценивали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCR).

Стереотаксическая операция с поражением 6-гидроксидофамином (6-OHDA) является широко используемой моделью крыс для изучения БП. В этом случае 6-OHDA вводится непосредственно в средний пучок переднего мозга (ССПМ), что приводит к разрушению дофаминовых нейронов. Контрольным крысам проводилась та же процедура, но им вводили 0,1%-ный раствор аскорбиновой кислоты в физрастворе.

Затем крысам с 6-OHDA имплантировали 20 000 астроцитов (AST) или астроцитов, экспрессирующих Th (AST-TH), в переднюю и заднюю части стриатума. До и после операции крысы проходили несколько поведенческих тестов, включая вызванные амфетамином вращения, цилиндр и тест на равновесие на наклонной балке, чтобы определить, улучшает ли имплантация астроцитов поведенческие характеристики геми-паркинсонических крыс.

Результаты исследования

Из 13 sgRNA, выявленных в ходе анализа, исследователи обсудили результаты работы TH4 sgRNA, поскольку она обеспечивала самый высокий уровень экспрессии белка Th. Клетки C6 и AST-TH, трансфицированные TH4 sgRNA, постоянно выделяли DA в культуральную среду, чего не наблюдалось в нетрансфицированных клетках. Экспрессия TH4 sgRNA была также подтверждена с помощью иммунофлуоресценции и Вестерн-блот анализа.

Поведенческие исследования показали, что крысы, получавшие первичные астроциты, демонстрировали значительно более выраженное круговое поведение по сравнению с крысами, получавшими клетки AST-TH. Аналогично, крысы, получавшие контрольные астроциты, демонстрировали значительные различия в асимметрии постановки передней конечности (FPA) в тесте с цилиндром по сравнению с крысами, которым были пересажены AST-TH.

Тест на равновесие на наклонной балке, используемый для измерения тонкого моторного контроля и равновесия, показал, что крысы, которым были пересажены AST-TH, демонстрировали сходные поведенческие характеристики с крысами, не страдающими паркинсонизмом.

Иммуногистохимический анализ мозга крыс показал, что в участках стриатума, в которые были имплантированы AST-TH, наблюдается повышенная экспрессия ДА, что сопоставимо с отсутствием ДА, наблюдаемым в пораженных участках мозга. Кроме того, оборот ДА в мозге, трансплантированном AST-TH, не нарушался, в то время как в стриатуме, обработанном контрольными астроцитами, оборот ДА не наблюдался. Полученные результаты свидетельствуют о том, что AST-TH улучшает скорость метаболизма ДА в мозге.

По сравнению с мозгом крыс, которым вводили контрольные астроциты, в мозге крыс, которым имплантировали AST-TH, наблюдалась совместная локализация Th и глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), последний из которых является биомаркером нейровоспаления.

https://www.news-medical.net/news/20230811/CRISPRsgRNA-SAM-therapy-a-potential-breakthrough-for-Parkinsons-disease.aspx